原理：
凝膠過濾層析是利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對分子質(zhì)量大小的差異進行洗脫分離的一項技術(shù)。
凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱為排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 一般是大分子先流出來，小分子后流出來。
使用方法：
⒈凝膠的選擇根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x擇不同型號的凝膠。如果實驗?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開，由于它們在分配系數(shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。
⒉柱的直徑與長度根據(jù)經(jīng)驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質(zhì)宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦校缓笤谖⑽⒌財嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應(yīng)低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路"或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。
⒌凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。
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